里氏木霉（里氏木霉菌的作用）

里氏木霉（T.reesei）

里氏木霉(T.reesei)是一种无性丝状真菌，是能够降解纤维素物质的重要丝状真菌之一，能够分泌一整套纤维素降解酶。其中，外切葡聚糖和纤维二糖水解酶的产量最高，占胞外分泌蛋白总量的60%以上。里氏木霉长期以来被用于生产纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶(王晓燕，2012年)。里氏木霉具有典型的真核生物蛋白质修饰特征和理想的蛋白质分泌能力。它已被用作基因工程宿主细菌来生产外源蛋白，并进行基因修饰，如N-糖基化途径的人源化，来生产药用人类蛋白。龙等完成的里氏木霉全基因组测序工作，对进一步了解这一工业菌株具有重要意义，为鉴定与其生长代谢相关的关键基因提供了良好平台。Chritian等人(2013年)分析了一种突变菌株里氏木霉Rut-C30，该菌株具有非常高水平的木聚糖酶表达(即使没有添加诱导物)。揭示了该菌株中编码木聚糖酶的Xyr1基因的单点突变导致了内源木聚糖酶表达的异常增加和纤维素酶表达的增加。这个突变位点通常位于双核锌簇的转录因子区域。但只有在槐糖的诱导下，纤维素酶的含量略有增加。在所有分析条件下，cbh1和cbh2的转录水平严格受xyr1的转录水平限制。与野生型QM6a不同，xyr1和cbh1/cbh2在突变菌株中的转录水平和槐糖诱导性方面没有严格的相关性，但在野生型菌株中有严格的相关性。Kautto等人(2013)结合生物化学、转录组学和激光共聚焦方法分析了里氏木霉纤维二糖水解酶 (CBHI)突变引起的细胞水平效应。突变体CBHI被荧光标记，融合蛋白的亚细胞定位系统被构建并与蛋白酶组相关联。突变的CBHI引起了Rut-C30的一些生理变化，如菌丝体，并影响了酶的分泌。一组与UPR和ERAD相关的基因sec61、der1、uba1、bip1、pdi1、prp1、cx1和lhs1被正向调节。此外，mg 132(n-苯甲酰羰基(cbz)-亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸)抑制蛋白酶的功能。MG132对蛋白酶编码基因有特殊作用。本研究首次报道了丝核菌蛋白酶对蛋白质品质的调节。激光共聚焦分析表明，突变CBHI在内质网中积累，并与蛋白酶共存。本研究揭示了在一定的分泌压力下，里氏木霉Rut-C30的高产蛋白是有限度的。利用分子标记技术获得突变体已成为基因克隆和遗传分析最有效的方法之一。建立里氏木霉基因标签插入突变体库是该领域功能基因组学的发展趋势(钟等，2007)。张等(2011)建立了一个高效的T-DNA插入突变筛选系统。他们认为，农杆菌介导的T-DNA转化作为建立插入突变和研究基因功能的有效手段，需要同样有效的转化和筛选步骤。利用绿色荧光蛋白(GFP)作为重要标记，研究人员建立了里氏木霉的高效T-DNA插入突变和筛选系统。将尿苷营养缺陷型菌株M23转移到农杆菌EH105携带的双向质粒pCOEP中，该质粒整合了pyrG基因(用于在不含尿苷的基本培养基中进行初步筛选)和egfp基因(用于对遗传稳定的菌株进行荧光筛选)。转化效率可达10 ~ 20个转化子/105个靶孢子。在荧光显微镜下，分生孢子、生长菌丝和菌丝中都可以检测到GFP荧光蛋白的强信号。通过96孔板记录荧光强度和多标记计数，建立了一种快速有效的筛选里氏木霉T-DNA标签突变体的方法。此外，通过Southern印迹分析确定T-DNA在基因组中的插入状态。本研究以绿色荧光蛋白为重要标记，建立了快速鉴定里氏木霉T-DNA插入突变和功能基因分析的方法体系。在木霉菌的研究中，菌株的有效筛选标记数量有限，难以实现菌株的多基因连续敲除。因此，丝状真菌选择标记缺失体系的建立有利于丝状真菌的多次遗传修饰。

尿嘧啶营养缺陷型标记具有转化效率高、易于获得转化子的优点。在研究中，通常将尿嘧啶营养缺陷型的互补基因pyrG转入相应的营养缺陷型菌株，使pyrG基因与受体菌株的缺陷基因互补，受体菌株显示野生型生长作为选择标记。在构建基因敲除载体时，在标记基因的联合检测中加入一个短的正向重复序列，这样就可以将转化子中的pyrG基因切掉，然后在添加5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基上筛选得到没有标记基因的目的基因敲除菌株。通过这种策略，可以在多基因敲除中重复使用选择性标记，而无需引入其他标记基因(王晓燕等人，2012)。在基因工程研究中，影响外源蛋白产量的因素包括启动子强度、启动子拷贝数、信号肽和蛋白稳定性。内源基因的高表达可能影响外源蛋白的产生。王燕等(2012)认为，当里氏木霉表达外源蛋白时，主要内源基因如cbh1、cbh2、eg1、eg2的相对高表达必然会影响外源基因的表达。基于这一背景，他们构建了里氏木霉主要的内源性纤维素酶基因缺失菌株，目的是增加外源蛋白的表达。他们利用重组PCR技术构建了以尿嘧啶缺失(pyrG)为选择标记的cbh1和cbh2敲除盒，并添加了一个短的正向重复序列，以保证被选择标记基因的重复使用。用两个敲除盒转化里氏木霉tku70菌株，在基本培养基上筛选得到单个敲除菌株CB h1:pyrg和CB H2:pyrg。然后用5-氟乳清酸筛选CB h1:pyrg，得到了没有标记基因的CB h1基因敲除菌株CB h1。在cbh1敲除的基础上，进一步敲除cbh2，构建了双基因双敲除菌株CB h1CB H2:pyrg。

-氟乳清酸反筛去除标记基因得到双敲除菌株 Δcbh1Δcbh2。接着对 T.reesei 转化子进行了 PCR，Southern验证和PAGE 分析，实验结果表明基因缺失菌株构建成功，其中 Δcbh1和Δcbh1Δcbh2菌株已不含有原先转入的筛选标记基因。菌株培养物上清液PAGE电泳分析：cbh1缺失菌株Δcbh1外切葡聚糖酶I的量与出发菌株相比明显下降，而外切葡聚糖酶II的分泌量有所提高；cbh2缺失菌株Δcbh2：：pyrG+外切葡聚糖酶Ⅰ的量与出发菌株相比没有太大的变化，外切葡聚糖酶Ⅱ的分泌量有所下降；cbhl/lcbh2双缺失菌株Δcbh1Δcbh2外葡聚糖酶I和外切葡聚糖酶II的量与出发菌株相比均明显下降。该研究对T.reesei Δtku70菌株进行目的性的分子生物学遗传改造，成功构建了cbh1和cbh2 基因单敲除及双敲除菌株。研究中在标记基因两侧各添加一段短的重复序列使标记基因重复利用的策略为多基因的连续敲除提供了一条行之有效的途径。龙昊（2006）建立了pyrG基因选择标记建立的T.reesei转化体系。他们利用紫外线诱变技术获得了一株T.reesei pyrG基因缺陷菌株M23。该菌株在不含尿嘧啶核苷酸的培养基上无法生长，而转化含有pyrG基因的质粒pAB4-1后可正常生长。转化率为每微克质粒200～300个转化子，该研究构建的pyrG基因缺陷型菌株的获得为构建T.reesei的新遗传转化系统奠定了基础。钟耀华等（2007）利用农杆菌AGL1介导成功转化了T.reesei QM9414。研究将T-DNA随机插入T.reesei染色体中，获得一批T.reesei T-DNA插入突变体，并得到具有潮霉素抗性的转化子，转化效率和稳定性高。序列分析证明T-DNA为随机插入T.reesei染色体中的。研究共获得经分子验证的突变菌株200余株，建立了插入突变体库。他们进一步对突变体子库进行表型筛选，发现了7株形态异常的突变子，有其中两个突变子的T-DNA插入位点恰好位于同一个基因的不同位点，通过序列对比和系统分析，该基因编码类胡萝卜素双加氧裂解酶（CCD），被命名为TrCCD1基因。两个突变子的T-DNA插入位点分别位于TrCCD1的开放阅读框和启动子区（Promoter），分别被命名为ccdO和ccdP。两突变体比出发菌株在MM平板上生长减速近一半，菌落也相对疏松；在含0.2%TritonX-100的MM平板上生长始，突变子菌落形成长的气生菌丝，导致菌落蓬松；突变子的菌丝顶端与菌丝中间区域相比明显有变化，即菌丝顶端颜色变暗；突变子在PDA平板培养4d后，仅有中间部位产生绿色孢子，周边围绕白色菌丝，而出发菌株产孢面积明显较大。他们利用丙酮对分泌到培养基的类胡萝卜素进行吸光度检测和β-胡萝卜素高效液相色谱（HPLC）测定。突变菌株分泌到PDA培养基中的β-胡萝卜素比出发菌株降低近一半。说明TrCCD1基因的突变与类胡萝卜素的含量直接相关，而且在类胡萝卜素的代谢中具有重要作用。他们推测，突变影响了某种具有重要信号作用的类胡萝卜素分子的生成，从而导致了T.reesei菌丝生长和孢子发育的异常，也同时说明TrCCD1基因在生长发育过程中扮演了重要的调控作用。另外5株突变子（PM2，PM48，HP7，HP13和HPL1）也形态各异，与出发菌株有明显区别，菌丝延伸较慢，有的菌落呈明显辐射状，有的菌落布满白色菌丝，无产孢迹象。其中PM2的菌丝顶端弯曲缠绕，形成了卷曲成团的头部。通过TAIL-PCR扩增分析，PM48的插入位点在一个编码细胞周期相关蛋白的基因编码区，HPL1的插入位点编码的蛋白可能是一个多聚腺苷酸结合蛋白，该基因突变引起了纤维素降解能力的变化。为了获得纤维素降解突变菌株，钟耀华等（2007）利用CF11平板透明圈筛选法，筛选到4株纤维素降解突变子：PM3，PM23，HPL1和36H-6。其中，PM3和PM23的透明圈增大，HPL1和36H-6的透明圈减小。纤维素酶活力测定发现，各菌株的FPA活力在18～24h之间达到高峰值，其中PM3和PM23的FPA最高活力比出发菌株高30%以上，PM3也是最先达到酶活最大值的菌株，而PM23的FPA活力持续时间最长。突变子HPL1和36H-6的FPA活力始终低于出发菌株，HPL1的FPA活力一直处于较低水平，最高酶活力仅为出发菌株的三分之一；36H-6的酶活力随时间延长下降很快，48h就几乎丧失活力。各突变体菌株的CMCase都是在24h达到酶活高峰，PM3和PM23的最大酶活力比出发菌株高，而HPL1和36H-6比出发菌株低。值得注意的是，HPL1的FPA和CMCase活力始终处于较低水平。他们同样利用TAIL-PCR分析了HPL1菌株T-DNA右侧翼序列，发现该突变基因编码的蛋白可能是多聚腺苷酸结合蛋白，突变位点位于基因上游26bp处，基因功能与RNA加工和修饰有关。傅科鹤（2013）针对在玉米生产过程中拮抗T.reesei受到重金属等理化逆境因子，而影响其生物防治效果的现象，期望通过突变体菌株创造耐受或吸附重金属的生防菌剂，将对研究木霉菌剂与含重金属的化学农药混用具有实际意义。研究采用了ATMT突变体系统构建方法，构建了1800余株突变体的突变体库，其中一株高吸附突变体A01的铜吸附特性较为突出。当培养基内铜离子初始浓度为0.7mM，初始pH值为5.0时，AT01的铜吸附率达到了96.1%，几乎二倍于野生菌的铜吸附特性；同时，由于铜吸附作用，AT01的菌体颜色呈现明显的铜绿色，表明细胞吸附了大量的铜离子。进一步的透射电镜观察表明，铜进入细胞内后，主要累积在液泡中。通过Southern印记分析，该突变体为T-DNA单拷贝插入，并且其右边界全部缺失而左边界完整（通过反向PCR扩增插入位点侧翼序列）。进一步对插入点基因情况进行分析，发现T-DNA插入在一个基因家族的两个功能基因之间，未对功能基因进行直接破坏。通过生物信息学分析3个与铜吸附相关基因，分别为TM，Ctr2，Ctr3，其中TM编码转录因子，调控胞外低浓度铜胁迫下跨膜通道蛋白（与铜吸附相关）表达，从而促进细胞对铜吸附作用，维持胞内同正常浓度。当ATMT介导基因被敲除后，在含0.2m MBCS（铜螯合剂）的TPDA培养基中培养时生长受到明显限制，菌落直径仅为野生菌的18%，说明该基因对细胞铜吸收功能有重要作用，而且基因互补发现功能得到恢复。随后的荧光定位实验显示，培养基添加BCS后，TM编码蛋白具有表达信号，初期在核内表达，后期转移到胞壁与某些通道蛋白结合。另外两基因Ctr2，Ctr3为铜吸附相关功能基因，被敲除后，Ctr2铜吸附能力比野生型降低20%，Ctr3无明显变化。Ctr3y荧光定位互补结果表明，编码蛋白主要在细胞壁。物理诱变主要是紫外诱变方法被应用在T.reesei突变体系的构建中。乐易林等（2004）对T.reesei Rut C-30通过紫外照射进行诱变，选育出了一株高产木聚糖酶活力的菌株，其酶活比出发菌株提高。并通过正交试验证明了培养时间对产酶的影响最大，其次是磷酸钾和七水硫酸镁，培养温度对酶活影响最小。覃玲灵等（2011）利用T.reesei产纤维素酶的特性，通过紫外辐射诱变筛选出高产纤维素酶的突变菌株，进一步提高纤维素酶的产量，降低生产成本。研究者对T.reesei Rut C-30的孢子悬液进行紫外线诱变（处理40min，致死率83.5%，正突变率8.679%），刚果红筛选培养基初筛、液体发酵产酶复筛后，获得一株突变体A13，其滤纸酶活为4.328U/mL，比出发菌株提高了55.3%。六世代连续培养后，酶活力可以稳定在4.160U/mL，且遗传稳定性好。正交试验得到突变体A13产酶的最佳条件：1.00%微晶纤维素（碳源）、0.15%蛋白胨+0.05%硫酸铵（复合氮源），产酶温度28℃，优化后，A13的纤维素滤纸酶活比优化前提高了18.15%。另外，在微晶纤维素的产酶培养基中添加适量麦芽浸粉可促进产纤维素酶（添加1%麦芽浸粉）。随后对4株突变菌株及出发菌株进行RAPD分析，对RAPD-PCR反应体系进行优化筛选6个随机引物，对扩增条带进行聚类分析，结果显示突变菌株和出发菌株间具有较近的亲缘关系，但存在一定的遗传变异。

里氏木霉（T.reesei）的基因组

T.reesei是工业上纤维素酶和半纤维素酶的主要生产来源，这些酶用于将生物质解聚成简单的糖类，再转化成化学中间体和生物燃料例如乙醇。对T.reesei的基因组进行测序（Martinez et al.，2008），将reads组装成89个scaffold，大小为34Mbp，包含9219个基因。出乎意料的是，相比其他已测序的能降解植物细胞壁多糖的真菌，T.reesei基因组中编码的纤维素酶和半纤维素酶基因数目较少。许多T.reesei的碳水化合物活性酶编码基因并非随机分布，而是成簇地分布在与其他粪壳菌纲（Sardariomycetes）真菌的共线性区域之间。7.2.1.1 T.reesei基因组的特点利用鸟枪法对T.reesei的基因组进行测序，构建了3个文库，插入片段的大小分别为3kb，8kb和40kb，覆盖度为9倍，共得到 433863个 reads，利用 Jazz，Phred/Phrap/Consed等软件将这些数据组装成89个scaffold和97个contig，大小约为34Mb（Martinez et al.，2008）。比几个核型分析预测的基因组大小约大2.9%（Carter et al.，1992；Man-tyla et al.，1992；Herrera-Estrella et al.，1993），与物理方法预测的大小几乎一致。核型分析所用的遗传标记和在Genbank中发布的所有蛋白和RNA序列在该基因组中都能找到。因此，推测该基因组序列代表了T.reesei 99%以上的基因组信息。在基因组中发现了类似于I和II型转座子的重复序列，但都存在多个终止密码子。造成缺少活跃转座子的原因可能是由于T.reesei存在活跃的防御机制，例如重复诱导的点突变。这些转座子总数不超过基因组序列的1%，是目前已知的出现频率最低的真菌之一。在T.reesei的7个scaffold末端存在重复6核苷酸序列TTAGGG，该序列与粉红面包霉（Neurospora crassa）端粒重复序列相同。预测T.reesei 基因组含有9129个基因，与N.crassa中的基因数目相当（Galagan et al.，2003），但是比禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum，其有性态为Gibberella zeae）预测的基因数少了接近2500个（Cuomo et al.，2007）。T.reesei基因的平均大小为1793 bp，每个基因平均含有3.1个外显子，外显子的平均长度508 bp，内含子平均大小120 bp。7.2.1.2 T.reesei保守共线性为了解环境因素对基因组进化的影响，比较了T.reesei，F.graminearum和N.crassa共线性的区域。根据比较结果，推测许多基因组片段中基因的顺序在该种类出现时就已经改变，共线性的区段间存在很大的间隙（Galagan et al.，2005）。在很多情况下，T.reesei和其他粪壳菌纲（Sordariomycetes）真菌中这种间隙是很保守的。非共线性的区域通常包含对菌株适应性重要的基因（Galagan et al.，2005；Machida et al.，2005；Nierman et al.，2005）。另外一个值得注意的特点是在3个真菌（T.reesei，F.graminearum和N.crassa）中存在一些随种类出现就已发生的染色体重排，表明了基因组的高度动态性。7.2.1.3 T.reesei的蛋白结构域与盘菌亚门（Pezizomycotina）的其他真菌相比，T.reesei基因组中已知功能的蛋白质数量较少，与生物质降解有关的蛋白组成也不一样。T.reesei缺少与侵染和降解植物活体组织相关的蛋白，例如果胶裂解酶和果胶酯酶，这与其腐生习性相符。而且，在T.reesei中没有发现鞣酸酶和阿魏酸酯酶，表明其在半纤维素降解方面存在缺陷。7.2.1.4 T.reesei和其他真菌中的碳水化合物活性酶在CAZy数据库中，碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active enzymes，CAZymes）被分为不同的级别和种类。能切割、构建和重排寡糖和多糖的CAZymes在真菌生物学中扮演重要的角色，对优化生物质的降解也同样重要。尽管T.reesei是植物多糖的有效降解者和降解研究体系中的重要模式菌，但是在其基因组中含有的糖苷水解酶（GH）编码基因较少。T.reesei中仅含有200个GH编码基因，比植物病原菌Magnaporthe grisea（231个）和F.graminearum（243个）都少。T.reesei中含有103个糖基转移酶，接近粪壳菌纲（Sordariomycetes）中该类酶的平均数（96个）。在粪壳菌纲中，该酶类的变异性比GH小。这种趋势在世系内外皆存在，表明糖基转移酶控制的是比较基础性的胞内生命活动，其组成变化所反映的是物种的差异而非环境压力的不同。与植物多糖解聚过程有关的酶，通常携带一个碳水化合物结合组件（Carbohydrate-Binding Mole，CBM），该组件连接在催化区上。在已知的粪壳菌纲中，T.reesei的基因组中含CBM的蛋白数量最少。同样，T.reesei中碳水化合物酯酶的数量也是粪壳菌纲中最少的。包括T.reesei在内，粪壳菌纲真菌中相对缺少多糖裂解酶基因，而散囊菌纲真菌（Eurotiomycetes）含有的多糖裂解酶数量较多，平均有18个。在单细胞子囊菌纲（Ascomycetes）中没有发现多糖裂解酶。出人意料的是，在T.reesei基因组中仅发现了7个编码已知纤维素酶（内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶）的基因，在表7.4列出的能降解植物细胞壁的真菌中，T.reesei的纤维素酶基因的数量最少。如果加上GH61蛋白家族，这种趋势更加明显。半纤维素包含不同种类的多糖，完全降解它们需要一系列的酶。T.reesei基因组仅含有16个半纤维素酶基因，也是在真菌中数量较少的。同样，其分解果胶的酶数量为5个，也是在植物细胞壁降解真菌中数量较少的（Martinez et al.，2008）。表7.4 真菌基因组中的纤维素水解酶注：a纤维素种类：CBH1，外切纤维二糖水解酶Ⅰ，GH7；CBH2，外切纤维二糖水解酶Ⅱ，GH6；EG1，内切葡聚糖酶Ⅰ，GH7；EG2，内切葡聚糖酶Ⅱ，GH5_5；EG3，内切葡聚糖酶Ⅲ，GH12_1；EG4，糖苷水解酶家族，Cel61，GH61；EG5，内切葡聚糖酶基因Ⅴ，Cel45。7.2.1.5 蛋白分泌T.reesei能非常有效地分泌胞外酶，有些工业菌株1L培养液可以产生100g胞外蛋白（Cherry et al.，2003）。在T.reesei中发现了与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌途径中起作用蛋白的同源蛋白。这些蛋白多数是单拷贝，与酵母蛋白的相似性比与哺乳动物源相似蛋白的相似性更高。T.reesei含有三个与酵母的蛋白质二硫键异构酶（Pdi lp）同源的蛋白，这可能与T.reesei分泌的纤维素酶多数含有二硫键有关（Divne et al.，1994）。酵母der1和ufd1基因在T.reesei中都存在两个直系同源基因，它们与内质网相关的蛋白降解（ERAD）途径有关。此外，在T.reesei中发现了大多数已知ERAD组分的同源蛋白，但在Aspergillus niger基因组中却缺少ERAD组分同源蛋白（Pel et al.，2007）。这些数据表明，在T.reesei中，ERAD途径似乎比内质网分泌途径更过剩。S.cerevisiae中参与蛋白运转相关的蛋白直系同源物大多数能在T.reesei中找到，它们多数是单拷贝。酵母缺少与哺乳动物GTPase蛋白Rab2，Rab4，Rab5，Arf6和Arf10对应的蛋白，这些信号蛋白参与膜融合或囊泡的出芽，而在T.reesei和N.crassa中含有这些蛋白的直系同源物。酵母中质膜分泌小泡受体t-SNARE蛋白Sso1p，在T.reesei中有两个同源蛋白，研究表明，这两个Sso1同源蛋白具有不同的功能（Valkonen et al.，2007）。综上所述，这些研究表明T.reesei的膜运输系统比在S.cerevisiae中的更加多样化。7.2.1.6 T.reesei的CAZyme基因簇T.reesei中许多CAZyme的编码基因在基因组中不是随机分布的。有研究表明，9个与纤维素和半纤维素降解有关的蛋白编码基因共同分布在基因组的几个区域。通过对T.reesei基因组中所有CAZyme的编码基因定位发现，316个CAZyme中的130（41%）分布在25个不连续的区域，这些区域大小从14 kb到275 kb不等（总共约2.4Mb，约占基因组的7%）。这些区域中含有CAZyme基因的密度比随机分布基因密度大5倍。通过对基因簇中基因数量的分析，130个CAZyme的95个（73%）分布在基因组共线性区域的间隙。而这95个中的69个（72%）在F.graminearum含有直系同源物。有16个CAZyme与F.graminearum共线性，表明基因迁移是这些基因簇形成的主要因素，而基因复制的作用较小。在同一基因簇中的CAZyme基因很少是出自同一个CAZyme家族，这也表明基因的迁移在这些基因簇形成过程的作用比基因复制更大。CAZyme基因成簇分布表明其特殊的生物学功能，在基因簇中的CAZyme基因有70%编码GH。基因组中有24%的糖基转移酶基因和46%的GH基因分布在这些基因簇内，表明这些基因簇中的CAZyme基因大多数参与多糖的降解。与植物细胞壁降解有关的基因多数分布在富含CAZyme的区域的现象，也证实了这一点。T.reesei中有4个类似于扩展蛋白的基因（Saloheimo et al.，2002），其中3个分布在这些基因簇内。有趣的是，少量与真菌细胞壁合成有关的糖基转移酶编码基因也出现在CAZyme基因簇中，比如甘露糖基转移酶、几丁质合酶、a-糖基转移酶和β-糖基转移酶（Cabib et al.，2001）。结合对槐二糖和纤维素诱导的T.reesei转录组数据进行分析（Foreman et al.，2003），将槐二糖和纤维素诱导表达基因定位到基因组上，发现尽管不是所有成簇分布的GH基因都共表达，但是确实发现了一些相邻基因共表达的例子。例如，在T.reesei基因组第29条scaffold的CAZyme基因簇区，外切纤维二糖水解酶cel7a、纤维素膨胀因子和木聚糖酶4在槐二糖和纤维素诱导下同时表达。上述结果表明，CAZyme基因成簇分布具有重要的意义。由于这些区域与其他真菌没有共线性的信号，表明在T.reesei中这些基因发生了重排，这种重排对其在进化上是有利的。在几个CAZyme基因密度高的区域也包含与次级代谢有关的蛋白编码基因。在25个CAZyme基因簇中，有5个基因簇都包含一个聚酮合酶（PKS）或非核糖体肽合成酶（NRPS）基因。另外，与其他Sordariomycetes真菌相比，T.reesei中保留了大多数非核糖体肽合成酶（NRPS）的旁系同源基因。